lunes, 17 de septiembre de 2012

2.1.1.4. áreas de incubación


2.1.1.4.ÁREA DE INCUBACION
Los cultivos se incuban en un cuarto apropiado o en gabinetes o en cámaras de crecimiento; debe proporcionar un buen control de la temperatura (20-28 °C), la iluminación variable, según las necesidades: 1000 a 5000 lux y de humedad relativa (70%-80%). En el cuarto de incubación se instalan estanterías metálicas o de madera para colocar los cultivos. En el área debe incluirse también espacio para cultivos en agitación y para cultivos estáticos en oscuridad. Es necesario propiciar una buena distribución del aire en este cuarto para evitar zonas de recalentamiento por efecto de las luces o lámparas. Cuando se utilizan tubos fluorescentes, es conveniente sacar los transformadores fuera de este cuarto. La regulación de la temperatura se puede lograr por medio de aparatos de aire acondicionado de pared o de un sistema central. En cualquier caso es necesario tomar precauciones para evitar el calentamiento excesivo, instalando.
















Literatura consultada
Barry, A. y S. Gibson. 2002. Control de calidad en microbiología, en Dharan, M. Control de Calidad en los Laboratorios Clínicos. Ed. Reverté. Sevilla, España.
 Collins C.H. y Lyne Patricia M. 1989. Métodos Microbiológicos. ACRIBIA. 524 pp
Díaz, R., G. Gamazo e I. López Goñi.1995. Manual Práctico de Microbiología. 1ª edición. MASSON, S. A. España
Madigan, M. T., J. M. Martinko y J. Parker. 2003. Brock. Biología de los microorganismos. 10ª edición. Prentice Hall Iberia. España



2..1.1.3. Áreas de siembra aseptica


2.1.1.3.ÁREA DE SIEMBRA ASEPTICA
Área limpia, diseñada y construida para minimizar la contaminación por partículas viables y no viables y mantenerla dentro de límites prestablecidos. Cuando se trabaja con cultivos microbianos, la técnica aséptica se utiliza para prevenir la introducción de organismos adicionales al cultivo. Un ambiente propicio para el desarrollo de microrganismos es el conjunto medio de cultivo – explante, pudiendo destruir tales cultivos; por lo cual es necesario evitar los contaminantes. Es difícil lograr cultivos completamente estériles, ya que pueden existir virus en el interior explante, pero se puede controlar a los demás organismos tomando en cuenta las siguientes normas:

a) Trabajar en ambientes adecuados.
b) Esterilizar los medios de cultivo.
c) Desinfectar superficialmente los explantes, liberándolos de bacterias y hongos
                                                         METODLOGIA
1. Fundir el medio sólido que se encuentra en 2 tubos de 22x175 con 20 mL y en 4 tubos de 16x150 con 7 mL (preparados en la sesión anterior).
2. Una vez fundido el medio, colocar los 4 tubos de 16x150 con 7 mL de medio en posición inclinada y dejar solidificar. Los 2 tubos de 22x175 con 20 mL de medio mantenerlos en baño María a 50ºC.
a) Comprobación de esterilidad.
Actividad para 1 equipo por mesa.
1. Separar el tubo en el que colocaron la tira de papel filtro impregnada con esporas de Geobacillusstearothermophylus (indicador biológico de esterilidad) y etiquetar como “estéril”
2. Separar 1 tubo con caldo y en condiciones de asepsia colocar una tira de papel filtro impregnada con esporas de Geobacillus stearothermophylus (indicador biológico de esterilidad) y etiquetar como “control”.
3. Incubar los 4 tubos a 55ºC durante 48 horas.
b) Comprobación de zona aséptica.
1. Lavar y desinfectar la mesa, delimitar el área de trabajo y encender el mechero para crear una zona aséptica.
2. Colocar las 3 cajas de Petri con TSA o gelosa nutritiva a 10 cm (Caja 1), 15 cm (Caja 2) y 20 cm (Caja 3) de distancia del mechero y dejarlas destapadas durante 30 minutos.
c) Comprobación de técnica aséptica.
1. En condiciones de asepsia vaciar el contenido de los tubos (22x175) en dos cajas de Petri de plástico y dejar solidificar.
2. Marcar la caja por el reverso, dividiéndola en 2 secciones.
3. Esterilizar el asa al mechero, dejar enfriar y trazar una estría en el sector 1.
4. Incubar el material preparado en los incisos anteriores a 27°C durante 24 horas y registrar sus resultados en el cuadro 3.
5. Guardar los medios preparados para la práctica de técnicas de siembra de bacterias.
Cuadro 3. Resultados de la comprobación de esterilización, zona y técnica aséptica

2.1.1.2. Áreas de almacenamiento


               2.1.1.2.ÁREA DE ALMACENAMIENTO
Las células procedentes de cultivos primarios o de líneas celulares establecidas pueden almacenarse durante largos períodos de tiempo en temperaturas bajo cero. Para ello se utilizan sistemas criogénicos como veremos en el apartado siguiente. Con la criopreservación se favorece:
                              1. El mantenimiento de células sin tener que utilizar tejidos animales primario
                              2. Evitar la pérdida de la línea por contaminación
                             3. Evitar la pérdida de la línea por cambios genéticos Metodología


2.1.1.1. Preparación de medios de cultivos y Esterilización


2.1.1.1.PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO  Y ESTERILIZACION
fresco (entre 15 y 25°), con poca humedad y protegidos de la luz solar directa. Nunca se deben almacenar cerca de autoclaves, hornos, ni otra fuente de calor o vapor. Los medios de cultivo deshidratados son higroscópicos. Cuando los envases de estos medios de cultivo deshidratados son abiertos para su uso inicial, se debe tener la precaución de cerrarlos tan pronto como sea posible y mantenerlos bien cerrados para prevenir la entrada de humedad. La absorción de agua produce cambios de pH, formación de grumos, decoloraciones del polvo, etc., lo cual indica que deben ser descartados porque pueden haber sufrido cambios químicos o estar contaminados. Una vez que el medio de cultivo ha sido preparado y esterilizado, puede almacenarse a temperatura ambiente por un periodo máximo de 2 semanas protegido de la luz, o por periodos mayores a 12 -15ºC. Sin embargo, almacenados bajo refrigeración entre 2 y 8°C se prolonga la vida útil de los mismos, (nunca por debajo de 0ºC porque se destruye la estructura del gel). Los medios de cultivo se deben mantener en recipientes bien cerrados para evitar su deshidratación y cuando se usa tapón de algodón, se debe colocar por encima una envoltura de papel (Craft). Otro punto importante a tomar en cuenta, es que cada lote de medio de cultivo preparado debe pasar por un riguroso proceso de control de calidad, en donde se determinan sus propiedades fisicoquímicas (apariencia, pH, etc.) y microbiológicas (esterilidad y promoción de crecimiento) verificando que cumplan con los requisitos de calidad establecidos y por ende demostrar que son aptos para su uso.
 OBJETIVO
Al finalizar el trabajo práctico el estudiante estará en capacidad de: Preparar adecuadamente medios de cultivo a partir de sus ingredientes y a partir de medios de cultivo deshidratados. Indicar el método de esterilización apropiado


PROCEDIMIENTO
1. Leer cuidadosamente las instrucciones de preparación del medio de cultivo asignado.
2. Pesar la cantidad exacta del medio deshidratado o las porciones correctas de cada uno de los ingredientes. Cerrar inmediatamente el frasco de medio de cultivo.
3. Disolver la porción pesada de acuerdo con las indicaciones del fabricante. Si es necesario calentar se debe tener cuidado de no sobrecalentar.
4. Ajustar el pH final de cada lote de medio preparado, preferiblemente a temperatura ambiente (25°C). Para ello se debe tomar una alícuota de 50 mL, medir el pH y de ser necesario  ajustar al pH indicado utilizando HCl 0,1N o NaOH 0,1N. Luego hacer el ajuste de pH al resto del medio de cultivo utilizando la solución correspondiente pero 1 N.
5. Distribuir el medio de cultivo de acuerdo a las indicaciones señaladas por el profesor.
6. Identificar el lote de medio de cultivo preparado indicando su nombre, distribución y fecha de preparación.
7. Esterilizar de inmediato el medio de cultivo siguiendo las instrucciones señaladas en el trabajo práctico N° 8. Si se presenta algún inconveniente que impida su inmediata esterilización, el medio de cultivo se puede almacenar por un periodo máximo de 12 horas bajo refrigeración.

2.1.1. Áreas de un laboratorio de cultivos


2.1.1.AREAS DE UN LABORATORIO DE CULTIVO IN VITRO

Se pueden distinguir 3 areas importantes:
CAMARA DE FLUJO LAMINAR
Contenido:
Cabina de Flujo Laminar
Silla

Es llamada así por que contiene en su interior un Cabina de Flujo Laminar; es el área mas estéril del Laboratorio, todo lo que ingrese en esta área debe estar debidamente esterilizado (material de vidrio, agua destilada), y el personal deberá entrar con el equipo necesario, es decir, con guantes, tapones para oídos, forro para pies, Mandil limpio y mascarilla quirúrgica.
Esta área deberá ser limpiada después de realizar cualquier trabajo en su interior, para asegurar su condición aséptica.Esta zona debe estar completamente aislada de las otras, se debe evitar que entre el polvo o los insectos.Se puede reemplazar un cabina de flujo laminar, con una caja de vidrio con orificios para que puedan entrar las manos y los materiales necesarios, además el aislamiento se lo puede hacer con plástico y cinta metálica, esta forma es lo mas artesanal posible.



















AREA DESARROLLO IN VITRO:
Contenido:
Repisas de Vidrio de varios pisos
Lámparas de tubo fluorescente.
Frascos Sembrados.
Termómetro

Es el área donde se colocara el explante después de la siembra, y donde además se desarrollara durante todas fases del programa. El explante, será colocado sobre repisas de vidrio, con iluminación artificial



ÁREA DE TRABAJO:
Contenido:
Balanza analítica
Refrigeradora
Autoclave
Lavaplatos
Cocina
Es un área de transito abierto, en este lugar se recibe, procesa y desinfecta todo (sustrato, medio de cultivo, material), para que entre asépticamente a las cámaras


















2.1 medios de cultivos


2.1   MEDIOS DE CULTIVOS
Hoy esta técnica tiene numerosas aplicaciones como:
• Propagación masiva de plantas, especialmente para especies de difícil propagación por otros métodos, o en vías de extinción .
• Clonación de individuos de características agronómicas muy deseables durante todo el año
• Obtención de plantas libres de virus
• Producción de semillas sintéticas
• Conservación de germoplasma (conjunto de individuos que representan la variabilidad genética de una población vegetal)
• Obtención de metabolitos secundarios
• Producción de nuevos híbridos
• Mejora genética de plantas (incluyendo obtención de plantas transgénicas)
• Germinación de semillas.
• Producción de haploides.
• Estudios fisiológicos diversos 

unidad II: cultivos de tejidos vegetal


Cultivos de tejidos vegetal

El cultivo de tejido vegetal fue desarrollado a partir de la investigación de botánicos y fisiólogos vegetales desde 1950. Actualmente se ha convertido en una herramienta internacional importante en la selección, cruzamiento, control de enfermedades y producción en masa de cultivos de cosecha e involucra diferentes plantas en agricultura, horticultura, forestales y frutales. La ciencia del cultivo de tejidos vegetales debe su origen a la investigación sobre hormonas que controlan el crecimiento y desarrollo vegetal. Este conocimiento se combinó con las técnicas básicas de microbiología por las cuales los microorganismos se hacen crecer en medios estériles para la producción de microorganismos e identificación. Desde estas dos fuentes provino la tecnología por la cual las plantas u órganos de plantas se pueden multiplicar en gran número, o su crecimiento individual controlado, haciendo crecer pequeños trozos de tejido vegetal sobre una receta precisa de nutrientes en un recipiente estéril. A su escala mayor, como ocurre en la industria de la micropropagación, el cultivo de tejido se ha convertido en un proceso de manufactura que puede producir material vegetal libre o saneado de patógenos, de alta calidad, que puede atravesar fronteras internacionales. Sobre un enfoque más técnico, esta metodología ha provisto a la industria de cruzamiento, de las metodologías apropiadas para generar, almacenar o manipular germoplasma de valor o genéticamente inestable sobre su camino a través del proceso de cruzamiento, donde el vehículo eventual para la propagación será la semilla.
Qué es el cultivo de tejido vegetal?
El punto de partida para el cultivo de tejidos es la iniciación. Este es el proceso por el cual se trae material vegetal in vivo en un medio de cultivo estéril. Requiere la disección microscópica de la planta bajo condiciones estrictamente higiénicas con el propósito de transferir su punto de crecimiento o tejido que crece activamente (los tejidos meristemáticos) con seguridad y limpieza dentro de un recipiente estéril sin introducir microorganismos contaminantes. Las células y tejidos que crecerán y se desarrollarán desde este inicio dependerá de los objetivos del cultivo de tejidos. En algunos casos las células conformarán una masa aparentemente desorganizada, conocida como callo, en otros estarán presentes otras estructuras reconocibles como tallos, órganos, raíces, bulbos u otros órganos. Estos tejidos in vitro están ahora dentro de un microcosmos estéril de un recipiente de vidrio o de plástico; y son protegidos del medio exterior no estéril. Es esencial mantener la esterilidad del medio ambiente confinado en el recipiente, debido a que cualquier microorganismo que se gane la entrada al mismo crecerá oportunísticamente a una velocidad mucho más rápida que los tejidos vegetales y eventualmente colonizarán y matarán a los tejidos. Con el propósito de sostener el vigor de los tejidos vegetales y permitir que ellos crezcan, se multipliquen y desarrollen, esto es cultivar los tejidos, deben darse además ciertos requerimientos externos. Los tejidos pueden necesitar que se los apoye o sean colocados sobre o en el interior de la superficie de un gel acuoso solidificado con agar o ellos pueden colocarse en un medio líquido. Ellos también necesitarán de un suministro de los elementos minerales nutritivos que son esenciales para el crecimiento vegetal, también posiblemente algunas vitaminas, azúcares como fuente de energía y un cocktail de hormonas vegetales que se conoce que controlan el crecimiento y desarrollo de estos tejidos particulares. 

Difco y BBL. 2003. Manual de Medios de Cultivo Microbiológicos.

domingo, 2 de septiembre de 2012

Terminologia de uso comun en Biotecnologia


TERMINOS DE USO COMUN EN BIOTECNOLOGIA

1.       Ácido abscisión: Hormona vegetal que actúa en los casos de estrés hídrico de la cepa provocando una disminución de la transpiración de la planta que conlleva una pérdida de turgencia inhibiendo el crecimiento y el desarrollo normal de la misma

2. Anticodón: Secuencia de tres nucleótidos en el ARN transferente que se emparejan de forma complementaria con un codón específico del ARN mensajero durante la síntesis proteica para determinar un aminoácido concreto de la cadena polipeptídica.

 

2.       Autoclave: Una autoclave es un dispositivo para esterilizar el equipo y fuentes sujetándolas al vapor de alta presión en 121° C o más. Fue inventada por Charles Chamberland en 1879. La autoclave del término también se utiliza para describir una máquina industrial en la cual la temperatura y la presión elevadas se utilicen en el proceso de los materiales. La Autoclave de Chamberland está constituida por una Caldera de cobre de doble pared, de forma cilíndrica. La tapa de Cobre otorga un cierre hermético por un anillo de Caucho y asegurado por una serie de tornillos móviles y tuercas mariposas.

 

3.       Auxina: Sustancias naturales o de síntesis que actúan a muy baja concentración sobre el desarrollo de las plantas. Junto con otras fitohormonas controlan el desarrollo de vástagos, la formación de raíces y otros procesos fisiológicos de las plantas.

 

4.       Biotecnología: La biotecnología es un área multidisciplinaria, que emplea la biología, química y procesos, con gran uso en agricultura, farmacia, ciencia de los alimentos, ciencias forestales y medicina. Probablemente el primero que usó este término fue el ingeniero húngaro Karl Ereky, en 1919.

 

5.       Citosina: Compuesto químico que las células usan para elaborar los elementos fundamentales del ADN y el ARN. Es un tipo de pirimidina

 

 

 

 

 

6         Código Genético: Código cifrado por la disposición de nucleótidos en la cadena polinucleótida de un cromosoma que rige la expresión de la información genética en proteínas, es decir, la sucesión de aminoácidos en la cadena polipeptídica. La información sobre todas las características determinadas genéticamente en los seres vivos genética está almacenada en el ADN y cifrada mediante las 4 bases nitrogenadas. Cada sucesión adyacente de tres bases (codón) rige la inserción de un aminoácido específico. En el ARN la timina es sustituida por uracilo. La información se transmite de una generación a otra mediante la producción de réplicas exactas del código.

 

7         Codón: Secuencia de tres nucleótidos consecutivos en un gen o molécula de ARNm determinada por sus bases nitrogenadas, que especificará la posición de un aminoácido en una proteína

 

 

 

8 .Dogma central de la biología molecular: Dogma central de la biología molecular es un concepto que ilustra los mecanismos de transmisión y expresión de la herencia genética tras el descubrimiento de la codificación de ésta en la doble hélice del ADN. Propone que existe una unidireccionalidad en la expresión de la información contenida en los genes de una célula, es decir, que el ADN es transcrito a ARN mensajero y que éste es traducido a proteína, elemento que finalmente realiza la acción celular. El dogma también postula que sólo el ADN puede duplicarse y, por tanto, reproducirse y transmitir la información genética a la descendencia. Fue articulado por Francis Crick en 1958 por primera vez,1 y se restableció en un artículo de Nature publicado en 1970.2

 

 

9.       Enzimas de restricción: Enzimas bacterianas sintetizadas como reacción defensiva frente a la invasión de ADN extraño, como, por ejemplo, bacteriófagos ADN, a los que degrada mientras que el propio está protegido por metilaciones específicas. Cada una de estas enzimas escinden el ADN siempre en el mismo sitio, en loci específicos o secuencias objetivo. Son las tijeras de la ingeniería genética que abrieron las puertas a la manipulación genética.

 

 

 

 

10.   Etileno: El etileno o eteno es un compuesto químico orgánico formado por dos átomos de carbono enlazados mediante un doble enlace. Es uno de los productos químicos más importantes de la industria química. Se halla de forma natural en las plantas


 

 

 

11.   Explante: El concepto de explante se refiere a cualquier parte vegetal que ha sido separada de la planta, que puede ser un tejido (fragmentos de hojas, tallos, raíces, pétalos, etc.). Con excepción de los óvulos y el polen, los explantes están constituidos por tejidos y/o células somáticos. Cuando se extrae un explante de la planta se debe tener en cuenta el tamaño, la fuente, la edad fisiológica del mismo.

 

 

12.    Giberelina: La giberelina es una fitohormona. Se producen en la zona apical, frutos y         semillas. Sus funciones son: Interrumpir el periodo de latencia de las semillas, haciéndolas germinar. Inducir la brotación de yemas.  Promover el desarrollo de los frutos (floración).crecimiento longitudinal del tallo. Es opuesta a otra hormona vegetal denominada ácido abscísico.

 

13.    Kilobase (Kb): Unidad de tamaño de los ácidos nucleicos, correspondiente a una  longitud de 1000 nucleótidos. En ADN bicatenario se denomina kilopares de bases (Kbp).

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

14.   Micropropagacion: Práctica que consiste en multiplicar rápidamente y/o regenerar materia vegetal para producir una gran cantidad de nuevas plantas genéticamente idénticas, con métodos de laboratorio modernos.

 

15.    Medio MS: Técnicas de reproducción in vitro. Plantas ornamentales. Árboles frutales. Antecedentes. Objetivos. Metodología. Cámara de cultivo. Condiciones. Problemas. Jardín Botánico

 

16.     Plásmido: Forma no celular de vida, fragmento circular de ADN bicatenario que      contienen unos cuantos genes y se encuentran en el interior de ciertas bacterias. Actúan y se replican de forma independiente al ADN bacteriano y pueden pasar de unas bacterias a otras. Igual que los provirus no producen enfermedades pero inducen pequeñas mutaciones en las células. Se utilizan como vectores en manipulación genética

 

17.   Técnica de recombinación del ADN: El ADN recombinante es resultado del uso de diversas técnicas que los biólogos moleculares utilizan para manipular las moléculas de ADN y difiere de la recombinación genética que ocurre sin intervención dentro de la célula. El proceso consiste en tomar una molécula de ADN de un organismo, sea virus, planta o una bacteria y en el laboratorio manipularla y ponerla de nuevo dentro de otro organismo. Esto se puede hacer para estudiar la expresión de un gen, para producir proteínas en el tratamiento de una enfermedad genética, vacunas o con fines económicos y científicos

 

18.    Traducción genética: Cambio de la información contenida en la secuencia de los cuatro nucleótidos del ARNm por la debida al ordenamiento de los 20 aminoácidos en la estructura de las cadenas polipeptídicas. Cada aminoácido se une a una pequeña molécula específica de ARN que sirve para su identificación, denominado ARN de transferencia. Esta molécula transfiere los aminoácidos libres de la solución al punto de formación de las cadenas polipeptídicas cuando está indicado por las instrucciones contenidas en la molécula de ARN mensajero. El proceso tiene lugar en la interacción de los codones del ARNm con la región del anticodon de los aminoacil-ARNt. Se distinguen en ella las etapas de iniciación, elongación y terminación en la que participan diferentes factores proteicos.

 


 

 

19.    Transcripción genética: Biosíntesis de una molécula de ARN por polimerización de nucleótidos complementarios a un ADN patrón. Esta molécula de ARN es un precursor de ARNm y representa una copia fiel de la secuencia complementaria de ADN de la que ha sido transcrita. Una secuencia específica situada por delante del gen (promotor) actúa identificando el sitio de inicio de la transcripción.