Enzimas de restricción: producción de fragmentos de DNA para recombinación.Las
enzimas de restricción o endonucleasas de restricción fueron descubiertas por
Werner Aber, Hamilton Smith y Daniel Nathans. Estas son enzimas sumamente
específicas que catalizan la hidrólisis de los enlaces fosfodiéster de los
ácidos nucleicos y son capaces de cortar ambas hebras del DNA en lugares
específicos, creando de esta manera una serie de fragmentos.
Las enzimas de restricción trabajan únicamente sobre secuencias específicas
de bases nitrogenadas, el lugar donde se produce el corte se denomina sitio de
restricción y producen dos tipos de corte:
(1) corte con extremos cohesivos y
(2) corte con extremos romos
Los extremos cohesivos dejan porciones lineales a ambos lados del
fragmento, es decir, quedan pequeñas secuencias de bases sin aparear a cada
lado, siendo éstas complementarias entre sí, mientras que los extremos romos
son aquellos en los que no queda una porción lineal a ninguno de los lados.De
acuerdo a la especificidad de las enzimas de restricción, se conocen dos tipos:
-las enzimas de tipo I cortan en un sitio cercano al sitio de restricción,
a una distancia que varía aleatoriamente, y por ello no se suelen emplear para
DNA recombínate.
-Las de tipo II reconocen y cortan en la secuencia específica, y son las
más empleadas en este tipo de protocolos por su alta precisión.
-Las enzimas de restricción de tipo III son similares a las de tipo II en
cuanto a la precisión del lugar de corte, pero se diferencian de éstas en que
sólo cortan entre nucleótidos del mismo tipo, por ejemplo entre dos adeninas.
La tecnología del DNA
recombinante utiliza técnicas que provienen de la bioquímica de los ácidos
nucleicos unidas a metodologías genéricas desarrolladas originalmente para la
investigación de bacterias y de virus. La utilización del DNA recombinante es
una herramienta poderosa para el
aislamiento de poblaciones puras de secuencias específicas de DNA a partir de
una población de secuencias mezcladas. Los procedimientos básicos incluyen una serie de pasos:
1. Los fragmentos de
DNA se generan utilizando unas enzimas denominadas endonucleasas de restricción,
que reconocen y cortan las moléculas de DNA por secuencias nucleotídicas
específicas.
2. Los fragmentos
producidos mediante la digestión con enzimas de restricción se unen a otras
moléculas de DNA que sirven de vectores.
Los vectores pueden replicarse
autónomamente en una célula huésped y facilitan la manipulación de la molécula
de DNA recombinante recién creada.
3. La molécula de DNA
recombinante, formada por un vector que lleva un segmento de DNA insertado, se
transfiere a una célula huésped. Dentro
de esta célula, la molécula de DNA recombinante se replica, produciendo docenas
de copias idénticas conocidas como “clones”.
4. Al replicarse las
células huésped, las células descendientes heredan el DNA recombinante,
creándose una población de células idénticas, que llevan todas la secuencia
clonada.
5. Los segmentos de
DNA clonados pueden recuperarse de las células huésped, purificarse y
analizarse.
6. Potencialmente, el
DNA clonado puede transcribirse, su mRNA puede traducirse, y el producto génico
puede aislarse y examinarse. Fabricación del DNA recombinante.
Enzimas de
restricción.
La piedra angular de
la tecnología del DNA recombinante es un tipo de enzimas denominadas
endonucleasas de restricción. Estas enzimas, aisladas en bacterias, reciben
este nombre debido a que limitan o previenen las infecciones víricas degradando
el ácido nucleico invasor. Las enzimas de restricción reconocen una secuencia
específica de nucleótidos (denominada sitio de restricción) de una molécula de
DNA de doble cadena, y cortan el DNA por esa secuencia. El premio Nobel de 1978 se otorgó a Werner Arber, Hamilton Smith
y Daniel Nathans por su investigación
sobre las enzimas de restricción. Hasta la fecha, se han aislado y
caracterizado casi 200 tipos de enzimas de restricción diferentes.
. El corte del DNA
en este sitio produce colas de cadena
sencilla complementarias. Las colas de cadena sencilla resultantes pueden unirse con colas complementarias de otros
fragmentos de DNA para formar moléculas de DNA recombinante.
Las enzimas de
restricción se denominan según el organismo en el que se descubrieron,
utilizando un sistema alfanumérico. La enzima EcoRI proviene de Escherichia
coli; HindIII se descubrió en Hemophilus influenzae. Hay dos tipos de enzimas
de restricción:
• Las enzimas de Tipo
I cortan las dos cadenas del DNA en una posición aleatoria a cierta distancia
del sitio de restricción. No se utilizan normalmente en la investigación de DNA
recombinante ya que el sitio de corte no es preciso.
• Las enzimas de Tipo II
reconocen una secuencia específica y cortan las dos cadenas de la molécula de
DNA con absoluta precisión dentro de la
secuencia reconocida. Se usan ampliamente en investigación de DNA recombinante
puesto que cortan en sitios específicos. Las secuencias reconocidas por las
enzimas de Tipo II son simétricas (“palindrómicas”), es decir, la secuencia de
una de las cadenas leída en dirección 5' Ö 3' es la misma que la secuencia de
la cadena complementaria leída también en dirección 5' Ö 3'.La enzima EcoRI
corta las cadenas de manera escalonada dentro del sitio de reconocimiento,
dejando extremos de cadena sencilla. Estas colas, que tienen secuencias nucleotídicas
idénticas, son “pegajosas” (cohesivas), ya que pueden unirse a colas complementarias
de otros fragmentos de DNA mediante
puentes de hidrógeno. Si moléculas de DNA de
diferente origen comparten los mismos sitios de reconocimiento palindrómicos, ambas tendrán colas
complementarias de cadena sencilla cuando se traten con una endonucleasa de
restricción. Si estos fragmentos se ponen juntos bajo determinadas
condiciones, los fragmentos de DNA de distinto origen pueden formar moléculas
recombinantes estableciendo puentes de hidrógeno entre los extremos cohesivos.
Luego se utiliza la enzima DNA ligasa para unir covalentemente los esqueletos
azúcar-fosfato de los dos fragmentos, produciéndose así una molécula de DNA
recombinante. Para formar moléculas de DNA recombinante, se corta DNA de
distintas fuentes con EcoRI y se mezcla para que se unan formando moléculas
recombinantes. Después se utiliza la
enzima DNA ligasa para unirlos covalentemente en moléculas de DNA recombinante.
Enzimas de
restricción.
La piedra angular de
la tecnología del DNA recombinante es un tipo de enzimas denominadas
endonucleasas de restricción. Estas enzimas, aisladas en bacterias, reciben
este nombre debido a que limitan o previenen las infecciones víricas degradando
el ácido nucleico invasor. Las enzimas de restricción reconocen una secuencia
específica de nucleótidos (denominada sitio de restricción) de una molécula de
DNA de doble cadena, y cortan el DNA por esa secuencia. El premio Nobel de 1978 se otorgó a Werner Arber, Hamilton Smith
y Daniel Nathans por su investigación
sobre las enzimas de restricción. Hasta la fecha, se han aislado y
caracterizado casi 200 tipos de enzimas de restricción diferentes.
. El corte del DNA
en este sitio produce colas de cadena
sencilla complementarias. Las colas de cadena sencilla resultantes pueden unirse con colas complementarias de otros
fragmentos de DNA para formar moléculas de DNA recombinante.
Las enzimas de
restricción se denominan según el organismo en el que se descubrieron,
utilizando un sistema alfanumérico. La enzima EcoRI proviene de Escherichia
coli; HindIII se descubrió en Hemophilus influenzae. Hay dos tipos de enzimas
de restricción:
• Las enzimas de Tipo
I cortan las dos cadenas del DNA en una posición aleatoria a cierta distancia
del sitio de restricción. No se utilizan normalmente en la investigación de DNA
recombinante ya que el sitio de corte no es preciso.
• Las enzimas de Tipo
II reconocen una secuencia específica y cortan las dos cadenas de la molécula
de DNA con absoluta precisión dentro de
la secuencia reconocida. Se usan ampliamente en investigación de DNA
recombinante puesto que cortan en sitios específicos. Las secuencias
reconocidas por las enzimas de Tipo II son simétricas (“palindrómicas”), es
decir, la secuencia de una de las cadenas leída en dirección 5' Ö 3' es la
misma que la secuencia de la cadena complementaria leída también en dirección
5' Ö 3'.La enzima EcoRI corta las cadenas de manera escalonada dentro del sitio
de reconocimiento, dejando extremos de cadena sencilla. Estas colas, que tienen
secuencias nucleotídicas idénticas, son “pegajosas” (cohesivas), ya que pueden
unirse a colas complementarias de otros fragmentos de DNA mediante puentes de hidrógeno. Si
moléculas de DNA de diferente origen
comparten los mismos sitios de reconocimiento
palindrómicos, ambas tendrán colas complementarias de cadena sencilla
cuando se traten con una endonucleasa de restricción. Si estos fragmentos
se ponen juntos bajo determinadas condiciones, los fragmentos de DNA de
distinto origen pueden formar moléculas recombinantes estableciendo puentes de
hidrógeno entre los extremos cohesivos. Luego se utiliza la enzima DNA ligasa
para unir covalentemente los esqueletos azúcar-fosfato de los dos fragmentos,
produciéndose así una molécula de DNA recombinante. Para formar moléculas de
DNA recombinante, se corta DNA de distintas fuentes con EcoRI y se mezcla para
que se unan formando moléculas recombinantes. Después se utiliza la enzima DNA ligasa para unirlos
covalentemente en moléculas de DNA recombinante.
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Tecnología del DNA
Recombinante Técnica Cultek S.L.U.09.2006 www.cultek.c
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Recombinante Técnica Cultek S.L.U
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