4.2.3. Clonación de genes
4.2.4. Vectores de clonación
Para replicar el DNA
clonado se pueden utilizar distintos tipos de célula huésped. Uno de los
huéspedes más utilizados es la cepa de laboratorio K12 de E.coli. Ésta y otras
cepas de E.coli se utilizan como huésped
ya que están bien caracterizadas genéticamente y pueden aceptar un amplio
espectro de vectores, incluyendo los plásmidos, los fagos y los cósmidos. Para
crear moléculas de DNA recombinante se precisan varios pasos. Si se utiliza un
plásmido como vector, el procedimiento es el siguiente:
1. El DNA que se va a
clonar se aísla y se trata con una enzima de restricción para crear fragmentos
que acaben en secuencias específicas.
2. Estos fragmentos
se ligan a moléculas de plásmido que han sido cortadas con la misma enzima de
restricción, obteniéndose un vector recombinante.
3. El vector
recombinante se transfiere a células huésped bacteriano, generalmente por
transformación, un proceso en el que las moléculas de DNA cruzan la membrana de
la célula huésped transfiriéndose a su interior.
4. La célula huésped
se hace crecer en una placa de cultivo, donde formará colonias. Puesto que las
células de cada una de las colonias provienen de una sola célula inicial, todas
las células de la colonia, y los plásmidos que contienen, son genéticamente idénticas,
o clones. Se rastrean las colonias para identificar las que han incorporado el
plásmido recombinante.
La cepa de E.coli
huésped carece de enzimas de restricción y es recA (carece del gen que codifica
la proteína RecA, una ATPasa necesaria para los procesos de recombinación
genética), con objeto de reducir las
posibilidades de que el DNA recombinante sufra recombinación con el cromosoma
de la célula huésped. Bacillus subtilis
y la levadura Saccharomyces cerevisiae
también pueden actuar de huéspedes. Como se volverá a mencionar a lo largo de
este documento, los vectores plasmídicos
penetran en las células de E.coli
mediante un proceso de transformación.
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