Plásmidos.
Los plásmidos son
moléculas de DNA de doble cadena extracromosómicas de origen natural que tienen
un origen de replicación (ori+) y que se replican autónomamente en las células
bacterianas. Para poder utilizarlos en
ingeniería genética, se han modificado o diseñado muchos plásmidos de manera
que contengan un número limitado de sitios de restricción y genes de
resistencia a antibióticos específico.
El vector pBR322 fue
uno de los primeros plásmidos diseñados que
se utilizó en DNA recombinante. Este plásmido tiene un origen de replicación (ori+), dos genes de selección
(resistencia a los antibióticos ampicilina y tetraciclina), y algunos sitios de
restricción únicos. Mapa de restricción del plásmido pBR322, que muestra las
localizaciones de los sitios de las enzimas de restricción que cortan el plásmido
por un solo sitio. Estos sitios pueden utilizarse para insertar los fragmentos
de DNA a clonar. También se muestran las localizaciones de los genes de
resistencia a antibióticos. El gen de resistencia a ampicilina hay sitios de
restricción únicos para las enzimas RruI, PvuI y PstI. Si se introduce pBR322
en una célula bacteriana sin plásmidos y sensible a antibióticos, la célula se
convertirá en resistente a la tetraciclina y a la ampicilina. Si se inserta un fragmento
de DNA en los sitios de restricción RruI, PvuI, o PstI, se inactivará el gen de
resistencia a ampicilina, pero el gen de resistencia a tetraciclina seguirá
activo. Si este plásmido recombinante se transfiere a una célula bacteriana que
no contenga plásmidos, las células que contengan el plásmido recombinante
podrán identificarse, ya que serán resistentes a tetraciclina y sensibles a
ampicilina.
Con el paso del
tiempo se han desarrollado vectores plasmídicos más sofisticados, que ofrecen
diversas características útiles. Uno de estos plásmidos, que deriva de pBR322,
es el pUC18, que tiene las siguientes características:
1. El plásmido tiene
la mitad de tamaño que pBR322, lo que permite insertar fragmentos de DNA más
largos.
2. pUC18 se replica
produciendo unas 500 copias por célula, lo que significa unas 5 ó 10 veces más
que las que produce pBR322.
3. Tiene un gran
número de sitios de restricción únicos, agrupados en una región denominada
sitio de clonación múltiple (poliylinker).
4. El plásmido
contiene un fragmento de un gen bacteriano denominado lacZ, y el sitio de
clonación múltiple está insertado dentro de éste fragmento del gen. El gen lacZ normal
codifica la ß-galactosidasa, enzima que corta moléculas de azúcar. Cuando pUC18
se introduce en una célula huésped bacteriana que tiene el gen lacZ mutante, se
produce ß-galactosidasa funcional. La presencia de ß -galactosidasa funcional
en una colonia bacteriana puede detectarse mediante un ensayo colorimétrico.
Las células bacterianas que contienen pUC18 forman colonias de color azul
cuando crecen en un medio que contiene una sustancia denominada X-gal. Si hay
DNA insertado en elsitio de clonación múltiple, se interrumpe el gen lacZ y se forman colonias blancas. Las
colonias blancas, resistentes a ampicilina, contienen plásmidos con DNA
insertado. El plásmido pUC18 ofrece varias ventajas como vector de clonación.
Debido a su pequeño tamaño, puede aceptar fragmentos de DNA relativamente
grandes; se replica hasta un alto número de copias, y tiene un gran número de
sitios de restricción en el sitio de clonación múltiple, localizado dentro del
gen lacZ. Las bacterias que contienen pUC18 producen colonias de color azul si
crecen en un medio que contenga X-gal. El DNA insertado en el sitio de
clonación múltiple interrumpe el gen
lacZ, resultando en colonias blancas, lo que permite la identificación
directa de las colonias que tienen insertos de DNA clonados
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