3.5.2. Métodos de conservación
Tipos de almacenamiento in vitro
El
almacenamiento in vitro se puede clasificar, según su
duración, en "almacenamiento por corto plazo" (conocido en
inglés como "short-term storage") y en "almacenamiento por
largo plazo" (conocido en inglés como "long-term storage").
En el primer tipo, generalmente se utilizan técnicas de cultivo in vitro que fomenten el crecimiento
reducido, mientras que en el segundo se utiliza principalmente la
crioconservación (Withers et
al.1990, Wilkinson et al. 2003, Wang et al. 2005, Keller et al. 2006, Cousins y Adelberg 2008).
Almacenamiento por corto plazo y principales
factores involucrados
En
el almacenamiento por corto plazo los explantes permanecen in vitro hasta por 12 meses, manejando
condiciones de cultivo para retrasar el crecimiento y aumentar los intervalos
entre subcultivos (Withers et
al.1990, Wilkinson et al. 2003, Wang et al. 2005, Cousins y Adelberg 2008).
Por ejemplo, Marin y Duran-Vila (1991) conservaron segmentos nodales juveniles
enraizados de naranja dulce (Citrus sinensis), naranja trifoliada (Poncirus
trifoliata), lima mexicana (C. aurantifolia), toronja (C.
paradisi) y limón Eureka (C. limon) durante un año mediante esta
técnica.
Como
parte de las estrategias empleadas para disminuir el crecimiento de los
explantes y aumentar los intervalos entre subcultivos, está el reducir la
temperatura de los cuartos de crecimiento, modificar los medios de cultivo y
otros factores ambientales que se deben tomar en cuenta para optimizar el
almacenamiento (Withers et al. 1990, Engelmann 1991). A
continuación se hará referencia a los principales factores que se deben tomar
en consideración para el almacenamiento por corto plazo.
Encapsulación
En
la técnica de encapsulación se recubren embriones somáticos, yemas
gametofíticas (en briófitas) o ápices, con una cubierta gelatinosa, como por
ejemplo de alginato de calcio, para formar "semillas sintéticas". La
protección que provee el encapsulamiento confiere, a la vez, resistencia contra
la deshidratación y las bajas temperaturas durante el almacenamiento por corto
plazo (Engelmann 1991, Mallón et
al. 2007). Por ejemplo,
ápices de fresa de la variedad comercial "Senga Sengana" y moras de
la variedad comercial "Norma" permanecieron encapsulados durante
nueve meses. El medio de encapsulación contenía alginato de calcio y el medio
nutritivo con todas las sales minerales y vitaminas de MS. Cada ápice
permaneció dentro de la estructura gelatinosa en forma de perla, almacenado en
oscuridad a 4 °C (Lisek y Orlikowska 2004).Otros ejemplos fueron realizados con
microtallos (2-5 mm) de piña encapsulada también con alginato de calcio y
almacenada a 4 ° C. Estos mantuvieron la viabilidad y la capacidad de brotación
hasta por 45 días (Soneji et
al. 2002). Embriones
somáticos encapsulados de Citrus
reticulata Blanco cv.
Mandarino Tardivo di Ciaculli se mantuvieron viables por 60 días a 4 °C
(Germanà et al. 2007). En el caso de la papaya (Carica
papaya L.), Castillo et al. (1998) mencionaron el potencial
que presenta la encapsulación de embriones somáticos para el almacenamiento de
germoplasma, la producción y la propagación de clones, el fácil manejo, y la
facilidad para implementar la automatización a gran escala.
Almacenamiento por largo plazo y principales
factores involucrados
El
almacenamiento por largo plazo es muy seguro por lo que se usa extensivamente
en agricultura, horticultura, y forestería para la investigación y el monitoreo
ambiental (Benson et al. 2006). Esta técnica permite
almacenar semillas (Berjak et
al. 2000, Dussert et al. 2000), semillas sintéticas (Paulet
y Engelmann 1994), meristemas y ápices (Escobar et al. 2000, González-Arnao et al. 2000, Hirai y Sakai 2000, Panis et al. 2000b, Pennycooke y Towill 2000,
Takagi 2000, Thinh et al. 2000), polen (Inagaki 2000, Ng y
Daniel 2000, Towill y Walters 2000), células (Rei nhoud et al. 2000), callos y suspensiones
celulares (Panis et al. 2000a). Además, requiere de poco
espacio y mantenimiento (Paulet y Engelmann 1994, Matsumoto et al. 2001, Wang et al. 2005).
Se
considera que el almacenamiento por largo plazo es una práctica útil para
evitar la variación somaclonal en plantas con propagación vegetativa y permite
mantener los explantes sin alteración alguna bajo estas condiciones,
prácticamente por tiempo indefinido (Engelmann 1991). Papa (Zhao et al. 2005) y café (Kumar et al.2006) son dos especies
difíciles de almacenar por otros métodos. El café produce semillas
recalcitrantes, las cuales pierden viabilidad con rapidez durante el
almacenamiento convencional y los bancos de germoplasma ex situ presentan altos costos de
mantenimiento. Es por esto que el almacenamiento por largo plazo es una
alternativa adecuada. Los embriones de café pueden preservarse en nitrógeno
líquido (NL) hasta por un año, sin que estos sufran pérdida de viabilidad o
alteraciones por variación somaclonal (Kumar et
al. 2006, Santana-Buzzyet
al. 2007) Para el almacen
Técnicas de crioconservación
La
crioconservación clásica incluye la deshidratación inducida en condiciones
estériles en una cámara de flujo laminar, el pre-enfriamiento paulatino de los
materiales (se utilizan diferentes gradientes de temperatura, por ejemplo: 10,
8, 4, -20 y -40 °C, así como diferentes tiempos de permanencia en esas
temperaturas), la inmersión en NL sin crioprotectantes y, posteriormente, el
almacenamiento a –80 °C. Sin embargo, nuevas técnicas basadas en la eliminación
parcial de agua en los tejidos y el congelamiento inmediato de los explantes
han desplazado parcialmente a la técnica clásica (Dixit et al. 2004, Wang et al. 2005). Estas nuevas técnicas son:
(1) vitrificación, (2) encapsulación – deshidratación, (3) encapsulación –
vitrificación, (4) precrecimiento, (5) precrecimiento – deshidratación, (6)
desecación y (7) enfriamiento de gotas (Engelmann 2000, Dixit et al. 2004).
1) Vitrificación
La
vitrificación es un proceso que promueve la deshidratación celular y
"solidificación" de líquidos en ausencia de cristalización (se evita
la formación de cristales de hielo intracelulares que dañan los tejidos). Con
la "solidificación" se induce un estado con una estructura molecular
aleatoria pero que posee propiedades físicas y mecánicas similares a un sólido.
Esta transición del agua líquida a una fase amorfa cambia la conformación
estructural celular hacia una apariencia vidriosa (Matsumoto et al. 2001, Dixit et al. 2004, Wang et al. 2005, Benson et al. 2006). La vitrificación es
realizada previa al congelamiento por medio de una sustancia crioprotectante
(Matsumoto et al. 2001, Dixit et al. 2004, Wang et al. 2005).
Esta
técnica se recomienda para órganos complejos, como ápices de tallos, tejidos
embriogénicos y cultivos de células (Dixit et
al. 2004, Zhao et al. 2005). Además de los compuestos
usuales, mencionados anteriormente, en la solución crioprotectante se han
adicionado también otras sustancias. Por ejemplo, proteínas anticongelantes
como albúmina de suero bovino (BSA), epinefrina o el aminoácido prolina (PRO)
para incrementar la sobrevivencia, una vez terminada la fase de
crioconservación, en meristemas apicales de papa (Zhao et al. 2005). Wang y colaboradores (2005)
desarrollaron un protocolo donde se utilizó PRO en la solución crioprotectante
y se obtuvo una sobrevivencia de alrededor de 80% para explantes de los
cultivares taiwaneses de papaya "Tai-nung, Red Lady y Florida". Otro agente
crioprotectante es el Supercool X1000 (21st Century Medicine, Inc. USA), que es
un polímero de alcohol de polivinilo, el cual tiene una funciónsimilar a las
proteínas anticongelantes al inhibir la formación de hielo durante la
crioconservación (Zhao et al. 2005).
Se
ha encontrado que soluciones crioprotectantes, con productos como DMSO, pueden
ser tóxicas para algunas especies tropicales. Por lo tanto, la mezcla de la
solución crioprotectante y el producto debe ser cuidadosamente seleccionada
(Dixit et al. 2004, Zhao et al. 2005). Una vez aplicada la
solución líquida crioprotectante e inducida la vitrificación, los tejidos se
congelan con NL. Posterior al tratamiento con la solución crioprotectante y el
NL, los explantes son almacenados a ‑80 °C (Engelmann 2000, Dixit et al. 2004, Wang et al. 2005, Sant et al. 2008). Pennycooke
y Towill (2000) utilizaron una mezcla crioprotectante de DMSO, sacarosa y
glicerol durante 26 minutos a 22 °C para conservar ápices de tallo de camote (Ipomoea
batatas) y lograron la regeneración, ocho semanas después del
descongelamiento, con una sobrevivencia mayor al 80%. Durante
el descongelamiento, los explantes generalmente se colocan en un baño de María
a 40 °C por uno a dos minutos y luego son lavados con medio de cultivo
suplementado con sacarosa (0,4–1,2 M). Posteriormente, los explantes se colocan
en el mismo medio de cultivo para su recuperación y regeneración en condiciones
de adecuadas luz (Engelmann 2000, Dixit et
al. 2004, Wang et al. 2005, Sant et al. 2008). La
vitrificación en este contexto no debe ser confundida con el fenómeno de
hiperhidricidad descrito anteriormente, ya que en artículos anteriores a 1992
se usaba el mismo término. Debergh et al. (1992) sugirieron el uso
de la palabra hiperhidricidad en el segundo caso para evitar confusiones.
2) Encapsulación – deshidratación
La
encapsulación - deshidratación se ha utilizado con ápices de tallo y tejidos
embriogénicos. Los explantes se precultivan en una solución con concentración
alta de sacarosa (0,5-0,75 M) y luego son encapsulados en alginato de calcio o
en polioxietilen glicol (PEG); después se les aplica una deshidratación en la
cámara de flujo laminar (cuatro a cinco horas), se congelan con NL y se
mantienen a -80 °C por el período de almacenamiento. El descongelamiento se
realiza en baño de María a 40 °C por uno a dos minutos y se cultivan en medio
para la recuperación del crecimiento y regeneración (Ara et al. 2000, Dixit et al. 2004).
(3) Encapsulación – vitrificación
La
encapsulación - vitrificación es similar al anterior en cuanto al uso de
alginato de calcio para la encapsulación. Se diferencia del mismo por no
utilizar el precultivo de los explantes en una solución con alta concentración
de sacarosa, sino más bien por el uso de una solución crioprotectante (como se
menciona en la primera técnica) a 0 °C por unas horas, en su lugar, y por haber
sido usado específicamente para meristemas. Los meristemas son encapsulados en
medios que contienen altas concentraciones de azúcares (glicerol 2 M y/o sacarosa
0,4 M). Se congelan inmediatamente con NL y se mantie nen a -80 °C (Hi rai y Sa
kai 2003, Dixit et al. 2004). El proceso de descongelamie
nto es similar al utilizado en la técnica de encapsulación – deshidratación.
(4) Precrecimiento
El
precrecimiento se ha utilizado específicamente para embriones cigóticos y
somáticos. La técnica involucra el cultivo in
vitro previo de los embriones
en presencia de crioprotectantes por varios días. Posteriormente, los embriones
se congelan directamente en NL, para luego almacenarlos a -80 oC. El proceso de
descongelamiento es similar a la técnica de encapsulación – deshidratación
(Engelmann 2000, Dixit et al. 2004).
(5) Precrecimiento – deshidratación
En
el precrecimiento - deshidratación se utilizan segmentos de tallo previamente
cultivados en un medio alto en sacarosa, ABA o PRO. Posteriormente estos se
desecan en flujo de aire y se congelan directamente en NL. El proceso de
descongelamiento es similar a la técnica mencionada para la vitrificación
(Engelmann 2000, Dixit et al.2004).
Esta técnica también ha sido utilizada con callos embriogénicos de yuca (Manihot
esculenta) provenientes del Centro Internacional de Agricultura Tropical
(CIAT) en Colombia y del Instituto Internacional de Agricultura Tropical
(International Institute of Tropical Agriculture [IITA]) en Nigeria. Los callos
se trataron previamente con una solución crioprotectante alta en sacarosa, se
deshidrataron y, posteriormente se congelaron con NL (Danso y Ford-Lloyd. 2004).
6) Desecación
La desecación se ha utilizado sólo con semillas recalcitrantes y
estructuras haploides como polen y óvulos. En ella se realiza primero la
desecación de los tejidos o semillas en una cámara de flujo laminar o en un
aparato con aire comprimido estéril o en sílica gel y, luego se congelan las
estructuras con NL (Engelmann 2000, Dixit et
al. 2004). Por ejemplo, en el
caso de café, esta técnica permitió mantener la viabilidad de los embriones
durante al menos un año (Kumar et
al. 2006). En el caso de
tejidos haploides, como por ejemplo el polen de palma aceitera, la desecación
fue realizada por medio de vacío. El polen fue mantenido en almacenamiento
durante ocho años y, posteriormente, se observó que al germinar presentó una
viabilidad del 62%. Como comparador, este mismo polen se almacenó en frío
(entre -10 y -20 °C) y a temperatura ambiente. En el primer caso, el polen
permaneció viable durante un año y en el segundo caso, permaneció viable
solamente durante siete días (Tandon et
al. 2007).
7) Enfriamiento de gotas
En enfriamiento de gotas se ha realizado con ápices de tallos, los
cuales son pretratados con una solución crioprotectante y luego colocados sobre
papel aluminio, de manera que se formen gotas pequeñas de crioprotectante con
el ápice en el centro. Los explantes se congelan directamente con NL (Dixit et al. 2004). Un ejemplo exitoso fue
realizado con ápices de tallo de 18 cultivares de Colocasia esculenta (ñame). Los ápices fueron
desecados previamente con flujo de aire estéril y colocados en un medio de cultivo
MS suplementado con glicerol (2 M) y sacarosa (0,4 M). Luego, estos se
colocaron en una solución crioprotectante que consistió de medio líquido MS con
glicerol (3,26 M), etilén glicol (2,42 M), DMSO (1,9 M) y sacarosa (0,4 M).
Gotas de este medio con los ápices de C.
esculenta se colocaron sobre
una superficie plana con papel de aluminio y fueron congeladas con NL. En esta
investigación se obtuvo una tasa de regeneración de entre 73 y 100% (Sa nt et al.2008).
Técnicas de cultivo de tejidos para el almacenamiento por largo plazo
Además de la crioconservación, también existe la posibilidad de
almacenar tejidos in vitro por largo plazo sin el uso de NL,
retrasando el crecimiento al controlar factores como el estrés osmótico del
medio (Bessembinder et al.1993).
Esto se logra utilizando azúcares no metabolizables por las plantas como el
manitol o el sorbitol. Adicionalmente, se puede usar reguladores de crecimiento
que reduzcan la tasa de crecimiento y bajas temperaturas. Bessembinder et al. (1993) mantuvieron clones de C. esculenta durante ocho años a 9 °C, con
ciclos de transferencia cada tres años. En otro ejemplo, se mantuvieron los
meristemos de cultivares comerciales de banano almacenados entre 28 y 30 meses
en medios de cultivo con la mitad de la concentración de las sales minerales, a
22 oC con un fotoperiodo de 16 horas luz y transferencia cada dos meses
(Banerjee y Sharma 1988). Sin embargo, es importante señalar que tiempos
mayores de cultivo in vitro podrían inducir tasas más altas de
variación somaclonal (Sánchez-Chiang y Jiménez 2009)
Literatura citada
Ara, H; Jaiswal, U; Jauswal, V.S. 2000. Synthetic seed: Prospects and limitations. Current Science
78:1438-1444.
Banerjee,
N; Sharma, AK. 1988. In vitro response as a reflection of
genomic diversity in long-term cultures ofMusa. Theoretical and Applied
Genetics 76:733-736.
Benson, EE; Johnston, J; Muthusamy, J; Harding, K. 2006. Physical and
engineering perspectives of in
vitro plant cryopreservation. In: Gupta, DS; Ibaraki, Y. eds. Plant
Tissue Culture Engineering. Springer. Holanda. p.
441-476.
