.5.2.1. Factores que limitan el crecimiento

3.5.2.1. Factores que limitan el crecimiento

     

                                     Temperatura

Se produce una reducción en la actividad metabólica y, en consecuencia, en el crecimiento de los explantes, al disminuir la temperatura de cultivo (esta temperatura depende de los requerimientos de cada especie) (Engelmann 1991). Generalmente se utilizan temperaturas alrededor de los 4 °C para cultivos de clima templado y entre 10 y 15 °C para el germoplasma tropical (Keller et al. 2006). El control de la temperatura se combina usualmente con otros factores para lograr un crecimiento reducido. En banano, temperaturas reducidas se han combinado con reducción en la intensidad lumínica o la completa supresión de luz. La propagación vegetativa de los tallos de banano normalmente se realiza a 22 °C con una intensidad lumínica de 3000 lux. Si n embargo, para su almacenamiento por corto plazo, se colocan a 15 °C bajo una intensidad lumínica de 1000 lux (Banerjee y Sharma 1988).

Si se mantienen los explantes a temperaturas bajas (inferiores a 4 °C) por períodos prolongados, pueden presentarse daños fisiológicos, causados por el frío, que inciden en cambios en el metabolismo, en el contenido de proteínas, y en la composición y funcionamiento de las membranas (Engelmann 1991). Estos problemas pueden ser reversibles cuando no hay exposición prolongada a esta condición. Generalmente, las plantas tropicales son sensibles a daños por frío y la temperatura de almacenamiento depende de la sensibilidad particular de cada especie (Engelmann 1991). Por ejemplo, Gangopadhyay et al. (2005) determinaron  que la temperatura de almacenamiento óptima para microtallos encapsulados de piña (Ananas comosus L.) era de 8 oC para un periodo de 45 a 60 días.

En las especies no tropicales, la reducción de temperatura actúa, muchas veces, como señal para romper el estado de reposo de los explantes e inducir la activación de su crecimiento. Por ejemplo, el almacenamiento de lirio (Lilium longiflorum L.) a bajas temperaturas (0-10 °C) indujo la ruptura del estado de reposo que llevó, consecuentemente, a su germinación y floración. Por lo tanto, su almacenamiento in vitro debió ser realizado a 25 °C, en medio de cultivo con todas las sales minerales (a un cuarto de su concentración) y vitaminas del medio Murashige y Skoog (1962) (MS) y una concentración alta de sacarosa (9%) por 28 meses. Esta medida permitió mantener una viabilidad superior al 84% (Bonnier y Van Tuyl 1997). Además, en ese trabajo, el manejo de la temperatura se combinó con una reducción de los nutrientes disponibles en el medio de cultivo, aspecto que también es de gran importancia, como se discutirá a continuación. Ambas medidas permitieron retardar el proceso de crecimiento y prolongar el almacenamiento.

Medio de cultivo

La reducción en la concentración de elementos minerales y/o carbohidratos metabolizables (por ejemplo, sacarosa) en el medio de cultivo puede ser una estrategia importante para la reducción del crecimiento del explante (Engelmann 1991, Rao 2004). Otras medidas pueden ser el aumentar el potencial osmótico del medio (especialmente mediante el uso de carbohidratos no metabolizables, como el manitol), el uso de concentraciones mayores de gelificantes, la adición de ciertos reguladores de crecimiento (como el ácido abscísico [ABA]), o de otras sustancias (como el cloruro de magnesio) para reducir daños en el explante. Como consecuencia de las medidas anteriores, el explante absorbe los nutrientes más lentamente y ocurre una reducción en el crecimiento (Engelmann 1991). Por ejemplo, para disminuir un problema de necrosis en explantes de banano in vitro, se suplementó el medio de cultivo con 50-100 mg/l de cloruro de magnesio. Con esta medida se logró la recuperación del 90% de los explantes que se encontraban en estados iniciales de necrosis (Martin et al. 2007).

En el caso de Curcuma longa, una planta aromática tropical utilizada en la cocina del medio oriente y asiática, el uso de agar y altas concentraciones de sacarosa (10%) en el medio de cultivo permitió su almacenamiento durante 23 semanas (Tyagi et al. 2007).

Recipiente de cultivo

El volumen del recipiente de cultivo puede ser determinante para definir la frecuencia de subcultivos y el almacenamiento óptimo de los explantes (Engelmann 1991, Keller et al. 2006). Por ejemplo, en Curcuma longa se utilizaron envases con capacidad de 180 ml para el almacenamiento a corto plazo (durante seis semanas) y de 2,5 l para el almacenamiento más prolongado (durante 23 semanas). Esto permitió una optimización en el almacenamiento de esta especie al utilizar eficientemente al volumen del recipiente según las necesidades de crecimiento del explante (Cousins y Adelberg 2008).

Modificación del ambiente gaseoso

La reducción del crecimiento se puede lograr también al disminuir el nivel de oxígeno disponible para los explantes. Sin embargo, bajo esas condiciones de almacenamiento, a menudo se desarrollan tejidos hiperhídricos, necróticos y con crecimiento más lento (Engelmann 1991). La hiperhidricidad es un desorden fisiológico que se caracteriza por la apariencia vidriosa e hinchada en los tejidos, tallos turgentes, acuosos e hipolignificados y órganos translúcidos, verdes, quebradizos y con deformaciones en la cutícula y epidermis (Debergh et al. 1992, Chakrabarty et al. 2003, 2005). Cabe mencionar que la necrosis de explantes, a causa de la reducción de oxígeno, se ha logrado disminuir al adicionar nitrato de plata, giberelinas, fructuosa, calcio, ácido ascórbico y/o carbón activado al medio de cultivo (Engelmann 1991, Chakrabarty et al. 2005).

Un método para la modificación del ambiente gaseoso consiste en bajar la presión parcial del oxígeno usando atmósferas controladas o disminuyendo la presión atmosférica de la cámara. Esto ha permitido el almacenamientoin vitro de especies tropicales sensibles a bajas temperaturas (Engelmann 1991). Otro método para limitar el nivel de oxígeno disponible es el uso de una capa de aceite mineral o medio líquido para cubrir los explantes (Rao 2004).

1. Sustancias nutritivas: sales minerales –macro y micronutrimentos; además una fuente de carbono (usualmente sacarosa) para soportar una tasa de crecimiento elevada y debido a que los tejidos vegetales  in vitro no cuentan con un sistema fotosintético bien desarrollado, es decir, son parcialmente heterótrofos.

2. Promotores del crecimiento: aminoácidos, vitaminas del complejo B y fitorreguladores (principalmente de tipo auxinas y citoquininas). La necesidad de agregar estos componentes se debe a que se manipula el crecimiento y desarrollo, y no basta con los promotores del crecimiento que las mismas células vegetales producen.

3. Soporte inerte: todos los componentes del medio de cultivo están disueltos en agua y generalmente contienen agar o agentes gelificantes sintéticos como el Phytagel® para formar un gel que sirve de soporte al tejido. Por supuesto también se cultivan tejidos vegetales en medios líquidos.

4. Otros ingredientes: se refiere a componentes opcionales –algunos complejos- como el agua de coco, hidrolizado de caseína, extracto de levadura, carbón activado y sustancias naturales diversas.

5. Reguladores microambientales: el medio de cultivo debe ajustarse a un pH adecuado para la especie vegetal que se está cultivando. Lo usual es que sean ligeramente ácidos (5.5 a 

6.5). También se debe ajustar el potencial redox en aquellas especies que tienen problemas de oxidación rápida, agregando sustancias como PVP, L-cisteína, ácidos orgánicos quelantes, carbón activado, etc. Para prevenir la precipitación de cationes (como el Fe++) se debe añadir un quelante como el EDTA.