.5.2. Métodos de conservación

3.5.2. Métodos de conservación

Tipos de almacenamiento in vitro

El almacenamiento in vitro se puede clasificar, según su duración, en "almacenamiento por corto plazo" (conocido en inglés como "short-term storage") y en "almacenamiento por largo plazo" (conocido en inglés como "long-term storage"). En el primer tipo, generalmente se utilizan técnicas de cultivo in vitro que fomenten el crecimiento reducido, mientras que en el segundo se utiliza principalmente la crioconservación (Withers et al.1990, Wilkinson et al. 2003, Wang et al. 2005, Keller et al. 2006, Cousins y Adelberg 2008).

Almacenamiento por corto plazo y principales factores involucrados

En el almacenamiento por corto plazo los explantes permanecen in vitro hasta por 12 meses, manejando condiciones de cultivo para retrasar el crecimiento y aumentar los intervalos entre subcultivos (Withers et al.1990, Wilkinson et al. 2003, Wang et al. 2005, Cousins y Adelberg 2008). Por ejemplo, Marin y Duran-Vila (1991) conservaron segmentos nodales juveniles enraizados de naranja dulce (Citrus sinensis), naranja trifoliada (Poncirus trifoliata), lima mexicana (C. aurantifolia), toronja (C. paradisi) y limón Eureka (C. limon) durante un año mediante esta técnica.

Como parte de las estrategias empleadas para disminuir el crecimiento de los explantes y aumentar los intervalos entre subcultivos, está el reducir la temperatura de los cuartos de crecimiento, modificar los medios de cultivo y otros factores ambientales que se deben tomar en cuenta para optimizar el almacenamiento (Withers et al. 1990, Engelmann 1991). A continuación se hará referencia a los principales factores que se deben tomar en consideración para el almacenamiento por corto plazo.

                                     

                                                Encapsulación

En la técnica de encapsulación se recubren embriones somáticos, yemas gametofíticas (en briófitas) o ápices, con una cubierta gelatinosa, como por ejemplo de alginato de calcio, para formar "semillas sintéticas". La protección que provee el encapsulamiento confiere, a la vez, resistencia contra la deshidratación y las bajas temperaturas durante el almacenamiento por corto plazo (Engelmann 1991, Mallón et al. 2007). Por ejemplo, ápices de fresa de la variedad comercial "Senga Sengana" y moras de la variedad comercial "Norma" permanecieron encapsulados durante nueve meses. El medio de encapsulación contenía alginato de calcio y el medio nutritivo con todas las sales minerales y vitaminas de MS. Cada ápice permaneció dentro de la estructura gelatinosa en forma de perla, almacenado en oscuridad a 4 °C (Lisek y Orlikowska 2004).Otros ejemplos fueron realizados con microtallos (2-5 mm) de piña encapsulada también con alginato de calcio y almacenada a 4 ° C. Estos mantuvieron la viabilidad y la capacidad de brotación hasta por 45 días (Soneji et al. 2002). Embriones somáticos encapsulados de Citrus reticulata Blanco cv. Mandarino Tardivo di Ciaculli se mantuvieron viables por 60 días a 4 °C (Germanà et al. 2007). En el caso de la papaya (Carica papaya L.), Castillo et al. (1998) mencionaron el potencial que presenta la encapsulación de embriones somáticos para el almacenamiento de germoplasma, la producción y la propagación de clones, el fácil manejo, y la facilidad para implementar la automatización a gran escala.

Almacenamiento por largo plazo y principales factores involucrados

El almacenamiento por largo plazo es muy seguro por lo que se usa extensivamente en agricultura, horticultura, y forestería para la investigación y el monitoreo ambiental (Benson et al. 2006). Esta técnica permite almacenar semillas (Berjak et al. 2000, Dussert et al. 2000), semillas sintéticas (Paulet y Engelmann 1994), meristemas y ápices (Escobar et al. 2000, González-Arnao et al. 2000, Hirai y Sakai 2000, Panis et al. 2000b, Pennycooke y Towill 2000, Takagi 2000, Thinh et al. 2000), polen (Inagaki 2000, Ng y Daniel 2000, Towill y Walters 2000), células (Rei nhoud et al. 2000), callos y suspensiones celulares (Panis et al. 2000a). Además, requiere de poco espacio y mantenimiento (Paulet y Engelmann 1994, Matsumoto et al. 2001, Wang et al. 2005).

Se considera que el almacenamiento por largo plazo es una práctica útil para evitar la variación somaclonal en plantas con propagación vegetativa y permite mantener los explantes sin alteración alguna bajo estas condiciones, prácticamente por tiempo indefinido (Engelmann 1991). Papa (Zhao et al. 2005) y café (Kumar et al.2006) son dos especies difíciles de almacenar por otros métodos. El café produce semillas recalcitrantes, las cuales pierden viabilidad con rapidez durante el almacenamiento convencional y los bancos de germoplasma ex situ presentan altos costos de mantenimiento. Es por esto que el almacenamiento por largo plazo es una alternativa adecuada. Los embriones de café pueden preservarse en nitrógeno líquido (NL) hasta por un año, sin que estos sufran pérdida de viabilidad o alteraciones por variación somaclonal (Kumar et al. 2006, Santana-Buzzyet al. 2007) Para el almacen

Técnicas de crioconservación

La crioconservación clásica incluye la deshidratación inducida en condiciones estériles en una cámara de flujo laminar, el pre-enfriamiento paulatino de los materiales (se utilizan diferentes gradientes de temperatura, por ejemplo: 10, 8, 4, -20 y -40 °C, así como diferentes tiempos de permanencia en esas temperaturas), la inmersión en NL sin crioprotectantes y, posteriormente, el almacenamiento a –80 °C. Sin embargo, nuevas técnicas basadas en la eliminación parcial de agua en los tejidos y el congelamiento inmediato de los explantes han desplazado parcialmente a la técnica clásica (Dixit et al. 2004, Wang et al. 2005). Estas nuevas técnicas son: (1) vitrificación, (2) encapsulación – deshidratación, (3) encapsulación – vitrificación, (4) precrecimiento, (5) precrecimiento – deshidratación, (6) desecación y (7) enfriamiento de gotas (Engelmann 2000, Dixit et al. 2004).

1) Vitrificación

La vitrificación es un proceso que promueve la deshidratación celular y "solidificación" de líquidos en ausencia de cristalización (se evita la formación de cristales de hielo intracelulares que dañan los tejidos). Con la "solidificación" se induce un estado con una estructura molecular aleatoria pero que posee propiedades físicas y mecánicas similares a un sólido. Esta transición del agua líquida a una fase amorfa cambia la conformación estructural celular hacia una apariencia vidriosa (Matsumoto et al. 2001, Dixit et al. 2004, Wang et al. 2005, Benson et al. 2006). La vitrificación es realizada previa al congelamiento por medio de una sustancia crioprotectante (Matsumoto et al. 2001, Dixit et al. 2004, Wang et al. 2005).

Esta técnica se recomienda para órganos complejos, como ápices de tallos, tejidos embriogénicos y cultivos de células (Dixit et al. 2004, Zhao et al. 2005). Además de los compuestos usuales, mencionados anteriormente, en la solución crioprotectante se han adicionado también otras sustancias. Por ejemplo, proteínas anticongelantes como albúmina de suero bovino (BSA), epinefrina o el aminoácido prolina (PRO) para incrementar la sobrevivencia, una vez terminada la fase de crioconservación, en meristemas apicales de papa (Zhao et al. 2005). Wang y colaboradores (2005) desarrollaron un protocolo donde se utilizó PRO en la solución crioprotectante y se obtuvo una sobrevivencia de alrededor de 80% para explantes de los cultivares taiwaneses de papaya "Tai-nung, Red Lady y Florida". Otro agente crioprotectante es el Supercool X1000 (21st Century Medicine, Inc. USA), que es un polímero de alcohol de polivinilo, el cual tiene una funciónsimilar a las proteínas anticongelantes al inhibir la formación de hielo durante la crioconservación (Zhao et al. 2005).

Se ha encontrado que soluciones crioprotectantes, con productos como DMSO, pueden ser tóxicas para algunas especies tropicales. Por lo tanto, la mezcla de la solución crioprotectante y el producto debe ser cuidadosamente seleccionada (Dixit et al. 2004, Zhao et al. 2005). Una vez aplicada la solución líquida crioprotectante e inducida la vitrificación, los tejidos se congelan con NL. Posterior al tratamiento con la solución crioprotectante y el NL, los explantes son almacenados a ‑80 °C (Engelmann 2000, Dixit et al. 2004, Wang et al. 2005, Sant et al. 2008). Pennycooke y Towill (2000) utilizaron una mezcla crioprotectante de DMSO, sacarosa y glicerol durante 26 minutos a 22 °C para conservar ápices de tallo de camote (Ipomoea batatas) y lograron la regeneración, ocho semanas después del descongelamiento, con una sobrevivencia mayor al 80%. Durante el descongelamiento, los explantes generalmente se colocan en un baño de María a 40 °C por uno a dos minutos y luego son lavados con medio de cultivo suplementado con sacarosa (0,4–1,2 M). Posteriormente, los explantes se colocan en el mismo medio de cultivo para su recuperación y regeneración en condiciones de adecuadas luz (Engelmann 2000, Dixit et al. 2004, Wang et al. 2005, Sant et al. 2008). La vitrificación en este contexto no debe ser confundida con el fenómeno de hiperhidricidad descrito anteriormente, ya que en artículos anteriores a 1992 se usaba el mismo término. Debergh et al. (1992) sugirieron el uso de la palabra hiperhidricidad en el segundo caso para evitar confusiones.

2) Encapsulación – deshidratación

La encapsulación - deshidratación se ha utilizado con ápices de tallo y tejidos embriogénicos. Los explantes se precultivan en una solución con concentración alta de sacarosa (0,5-0,75 M) y luego son encapsulados en alginato de calcio o en polioxietilen glicol (PEG); después se les aplica una deshidratación en la cámara de flujo laminar (cuatro a cinco horas), se congelan con NL y se mantienen a -80 °C por el período de almacenamiento. El descongelamiento se realiza en baño de María a 40 °C por uno a dos minutos y se cultivan en medio para la recuperación del crecimiento y regeneración (Ara et al. 2000, Dixit et al. 2004).

(3) Encapsulación – vitrificación

La encapsulación - vitrificación es similar al anterior en cuanto al uso de alginato de calcio para la encapsulación. Se diferencia del mismo por no utilizar el precultivo de los explantes en una solución con alta concentración de sacarosa, sino más bien por el uso de una solución crioprotectante (como se menciona en la primera técnica) a 0 °C por unas horas, en su lugar, y por haber sido usado específicamente para meristemas. Los meristemas son encapsulados en medios que contienen altas concentraciones de azúcares (glicerol 2 M y/o sacarosa 0,4 M). Se congelan inmediatamente con NL y se mantie nen a -80 °C (Hi rai y Sa kai 2003, Dixit et al. 2004). El proceso de descongelamie nto es similar al utilizado en la técnica de encapsulación – deshidratación.

(4) Precrecimiento

El precrecimiento se ha utilizado específicamente para embriones cigóticos y somáticos. La técnica involucra el cultivo in vitro previo de los embriones en presencia de crioprotectantes por varios días. Posteriormente, los embriones se congelan directamente en NL, para luego almacenarlos a -80 oC. El proceso de descongelamiento es similar a la técnica de encapsulación – deshidratación (Engelmann 2000, Dixit et al. 2004).

(5) Precrecimiento – deshidratación

En el precrecimiento - deshidratación se utilizan segmentos de tallo previamente cultivados en un medio alto en sacarosa, ABA o PRO. Posteriormente estos se desecan en flujo de aire y se congelan directamente en NL. El proceso de descongelamiento es similar a la técnica mencionada para la vitrificación (Engelmann 2000, Dixit et al.2004). Esta técnica también ha sido utilizada con callos embriogénicos de yuca (Manihot esculenta) provenientes del Centro Internacional de Agricultura Tropical (CIAT) en Colombia y del Instituto Internacional de Agricultura Tropical (International Institute of Tropical Agriculture [IITA]) en Nigeria. Los callos se trataron previamente con una solución crioprotectante alta en sacarosa, se deshidrataron y, posteriormente se congelaron con NL (Danso y Ford-Lloyd. 2004).

6) Desecación

La desecación se ha utilizado sólo con semillas recalcitrantes y estructuras haploides como polen y óvulos. En ella se realiza primero la desecación de los tejidos o semillas en una cámara de flujo laminar o en un aparato con aire comprimido estéril o en sílica gel y, luego se congelan las estructuras con NL (Engelmann 2000, Dixit et al. 2004). Por ejemplo, en el caso de café, esta técnica permitió mantener la viabilidad de los embriones durante al menos un año (Kumar et al. 2006). En el caso de tejidos haploides, como por ejemplo el polen de palma aceitera, la desecación fue realizada por medio de vacío. El polen fue mantenido en almacenamiento durante ocho años y, posteriormente, se observó que al germinar presentó una viabilidad del 62%. Como comparador, este mismo polen se almacenó en frío (entre -10 y -20 °C) y a temperatura ambiente. En el primer caso, el polen permaneció viable durante un año y en el segundo caso, permaneció viable solamente durante siete días (Tandon et al. 2007).

7) Enfriamiento de gotas

En enfriamiento de gotas se ha realizado con ápices de tallos, los cuales son pretratados con una solución crioprotectante y luego colocados sobre papel aluminio, de manera que se formen gotas pequeñas de crioprotectante con el ápice en el centro. Los explantes se congelan directamente con NL (Dixit et al. 2004). Un ejemplo exitoso fue realizado con ápices de tallo de 18 cultivares de Colocasia esculenta (ñame). Los ápices fueron desecados previamente con flujo de aire estéril y colocados en un medio de cultivo MS suplementado con glicerol (2 M) y sacarosa (0,4 M). Luego, estos se colocaron en una solución crioprotectante que consistió de medio líquido MS con glicerol (3,26 M), etilén glicol (2,42 M), DMSO (1,9 M) y sacarosa (0,4 M). Gotas de este medio con los ápices de C. esculenta se colocaron sobre una superficie plana con papel de aluminio y fueron congeladas con NL. En esta investigación se obtuvo una tasa de regeneración de entre 73 y 100% (Sa nt et al.2008). 

Técnicas de cultivo de tejidos para el almacenamiento por largo plazo

Además de la crioconservación, también existe la posibilidad de almacenar tejidos in vitro por largo plazo sin el uso de NL, retrasando el crecimiento al controlar factores como el estrés osmótico del medio (Bessembinder et al.1993). Esto se logra utilizando azúcares no metabolizables por las plantas como el manitol o el sorbitol. Adicionalmente, se puede usar reguladores de crecimiento que reduzcan la tasa de crecimiento y bajas temperaturas. Bessembinder et al. (1993) mantuvieron clones de C. esculenta durante ocho años a 9 °C, con ciclos de transferencia cada tres años. En otro ejemplo, se mantuvieron los meristemos de cultivares comerciales de banano almacenados entre 28 y 30 meses en medios de cultivo con la mitad de la concentración de las sales minerales, a 22 oC con un fotoperiodo de 16 horas luz y transferencia cada dos meses (Banerjee y Sharma 1988). Sin embargo, es importante señalar que tiempos mayores de cultivo in vitro podrían inducir tasas más altas de variación somaclonal (Sánchez-Chiang y Jiménez 2009)

Literatura citada

Ara, H; Jaiswal, U; Jauswal, V.S. 2000. Synthetic seed: Prospects and limitations. Current Science 78:1438-1444.     

Banerjee, N; Sharma, AK. 1988. In vitro response as a reflection of genomic diversity in long-term cultures ofMusa. Theoretical and Applied Genetics 76:733-736.  

Benson, EE; Johnston, J; Muthusamy, J; Harding, K. 2006. Physical and engineering perspectives of in vitro plant cryopreservation. In: Gupta, DS; Ibaraki, Y. eds. Plant Tissue Culture Engineering. Springer. Holanda. p. 441-476.