2.1.4.3.MATERIALES
INERTES Y GELIFICANTES
Agentes solidificantes
Su agregado al medio de cultivo es opcional.
El más usado:
<!--[if !supportLists]-->- El agar, es un polisacárido
ácido derivado de algas marinas, formado principalmente por galactosa con un
grupo sulfato cada 10 a 50 restos. Suele contener sustancias nutritivas en
pequeñas concentraciones, y por esto no puede ser utilizado en medios de
composición química estrictamente definida destinados a autotrofos. Se usa sin
problemas en medios de cultivo complejos para quimioorganotrofos. Se agrega al
1.5-2% en medios de consistencia sólida normal, al 0.2-0.3% en medios
semisólidos o blandos, al 5% en medios de consistencia muy firme para detener
el crecimiento de gérmenes muy móviles, y al 0% cuando se preparan medios
líquidos (caldos).
Sus características:
<!--[if !supportLists]-->- <!--[endif]-->Funde a
80-100°C y permanece líquido hasta 50-55°C.
<!--[if !supportLists]-->- <!--[endif]-->A
45-55°C se pueden agregar suspensiones de células sin afectar la viabilidad
(supervivencia) de las mismas.
<!--[if !supportLists]-->- Permanece sólido a 37°C,
temperatura de incubación de la mayoría de las bacterias patógenas del hombre.
<!--[if !supportLists]-->- <!--[endif]-->No es
tóxico para las bacterias, ni es degradado por éstas.
<!--[if !supportLists]-->- Utilizado al 1.5-2%,
permite el aislamiento de colonias (poblaciones de microorganismos derivadas de
una única célula), lo que resulta imposible en medios líquidos!
<!--[if !supportLists]-->- <!--[endif]-->Es
transparente, lo que facilita la visualización de las colonias.
<!--[if !supportLists]-->- <!--[endif]-->Al
solidificar, forma una trama suficientemente abierta para permitir la difusión
de los nutrientes del medio de cultivo en todas direcciones, y suficientemente
cerrada –según la concentración empleada- para impedir la movilidad de los
microorganismos.
Otros solidificantes:
<!--[if !supportLists]-->-
<!--[endif]-->Agarosa: es agar muy transparente libre de sulfatos. Se usa
intensamente para fines específicos en Inmunología y Biología Molecular.
<!--[if !supportLists]-->-
<!--[endif]-->Silicagel: es silicato diluido en HCl. Se emplea en medios
de cultivo para autotrofos, cuando debe excluirse materia orgánica del medio de
cultivo.
<!--[if !supportLists]-->-
<!--[endif]-->Gelatina: es una proteína obtenida por hidrólisis del
colágeno. Fue el primer solidificante usado en Microbiología, pero es degradado
por la mayoría de las bacterias (lo comen, por lo que el medio inicialmente
sólido termina convertido en medio líquido) y la temperatura de incubación no
puede ser mayor a 22°C (es el punto de fusión) con lo que cultivos sólidos a
temperaturas más altas resultan inviables.
<!--[if !supportLists]-->-
<!--[endif]-->Albúmina de huevo, suero: a 80°C estas proteínas coagulan y
solidifican el medio de cultivo.
El gelificante suele ser un sólido que al añadirse a un
medio de cultivo se disuelve por calentamiento fuerte (cercano a los 100 ºC) y
hace que el medio adquiera la consistencia de gel al enfriarse a temperaturas
menores. Uno de los mejores agentes gelificantes de que se dispone para
realizar cultivos in vitro de tejidos vegetales es el agar, también conocido
como agar-agar. Los gelificantes deben cumplir con una serie de requisitos: no
ser asimilado por el explanto, lo que haría que al consumirse el medio
retornase a su estadio líquido, no interferir en la absorción de los nutrientes
del medio de cultivo, y permanecer estable durante el tiempo de cultivo.
El agar es un polisacárido natural no ramificado y de alto
peso molecular (3.000 a 160.000), extraído de algas rojas, Rhodofíceas,
principalmente del género Gelidium. Está formado por galactosidos que forman la
Agarosa, y de un polisacárido sulfatado, la Agaropectina. Además, contiene muy
pequeñas cantidades de cationes como impurezas (Na, K, Ca, Mg, etc.). Su
composición varía ligeramente en función de la especie de que se extrae, su
procedencia, época de cosecha, madurez del alga, etc. Los procesos de obtención
y purificación para producir los distintos tipos de agar afectan principalmente
a su contenido en impurezas.
La principal característica que hace del agar un gelificante
es su total disolución en agua al ser calentado a 85-100 ºC, y su gelificación
alrededor de los 35 ºC. Es termoreversible, es decir, se puede volver a
disolver y a gelificar repetidas veces mediante variaciones en la temperatura,
y es autoclavable. Su gelificación depende del pH del medio de cultivo, siendo
óptima para pH 5.4-5.7. Los medios de cultivo para tejidos vegetales suelen
ajustarse a pH = 5.7 antes de añadir el agar, por lo que melifican bien; tras
la gelificación el agar absorbe una cantidad de agua de hasta 200-300 veces su
peso, y forma un gel muy translúcido. La preparación de los medios de cultivo
para vegetales incluye generalmente un aporte de agar del 0.8%.
Entre los compuestos alternativos al agar para utilizarse
como gelificantes en el cultivo in vitro de tejidos vegetales tenemos:
• Alginatos. Excelentes para cultivo de células en
suspensión y de protoplastos.
• Agarosa. Es uno de los polímeros del agar, obteniéndose a
partir de él. Se utiliza más en electroforesis de proteínas o ácidos nucleicos
que en cultivo in vitro.
• Fitagel. Conocido también con el nombre gelrita, marca
registrada de Merck; es de amplio uso.
• Ficoll. Es un derivado de polisacáridos que produce medios
de cultivo de tipo coloidal. Encuentra una aplicación importante en el cultivo
de anteras.
El fitagel es un polisacárido aniónico obtenido por
fermentación bacteriana. El gel que forma se caracteriza principalmente por:
• Gran transparencia, que facilita el seguimiento del
cultivo.
• El medio nutritivo se gelifica con un aporte de fitagel de
tan sólo el 0.2%
• Precisa de cationes divalentes para su gelificación,
principalmente Mg o el Ca.
• Se disuelve y gelifica en respuestas a cambios de
temperaturas, como el agar, si bien no es termoreversible.
• Los explantos cultivados en medios con fitalgel absorben
los nutrientes con mucha facilidad, lo que permite un crecimiento mas rápido,
sin embargo la velocidad de absorción puede ser excesiva, no pudiendo
incorporarse a sus estructuras y compuestos sino que quedarían en solución
dentro del explanto, causando el problema conocido típicamente como
hiperhidricidad, frecuente en cultivos de tipo leñoso.Su coste es mucho menor.
http://cv.udl.cat/cursos/76304/t5/t5.htm
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